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選液相色譜柱了解這些才能少走冤枉路
  • 發布日期:2019-04-11      瀏覽次數:1030
    • 現代液相色譜分析中,色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞,選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發所需的時間,并且使方法更具穩定性。

      這里為大家提供一個液相色譜柱選擇的簡單思路:

      1.確定分離目的確定你的應用是否要求高分離度、短分析時間、高靈敏度、長柱壽命,低的實驗成本等。

      2.評估分析物的化學性質評估分析物的化學性質諸如化學結構、溶解性、穩定性等。

      3.選擇合適的色譜柱了解色譜填料的物理和化學性質。

      想要選適合的液相色譜柱,你需要先詳細了解它。這樣才能少走冤枉路!

       

      液相色譜柱的參數——物理性質

       

      柱長,內徑,如250*4.6mm。

      長度的選擇:柱越長,總柱效越高(n值越大),柱越長,分析時間也越長。250—300mm是普遍的柱長,實驗室一半以上的工作都是采用此規格柱子,一般用來分離l0到50個組份的中等至復雜混合物;500—600mm,要求較高分辨率的應用,—般用來分離大于50個組份或包含有難分離物質的復雜樣品程序升溫分析。

      內徑:柱效率與柱半徑平方成反比,內徑越小柱效越高,但內徑越大,柱容量也增加,允許進樣量就越多。當進樣量超過柱容量時,則因柱內每塊理論板內不能建立真正的平衡,將會導致色譜蜂畸變,柱分辨率降低,重現性不好。因此對于復雜樣品需要準確分離,應使用小內徑柱子。另一方面若樣品中存在具有很不相同濃度組份化合物,為了增加樣品容量就應使用內徑大的柱子,目前實驗室使用常見的柱子內徑一般是4.6mm。

      一般選擇原則:分析大分子量化合物選擇大孔徑色譜柱;對于高pH值或者堿性化合物需要選擇高封端或者特殊封端的色譜柱,以改善峰形,延長色譜柱使用壽命等。

      粒徑,影響色譜分離度。

      粒徑越小柱效越高、分離度越高,但同時會導致較高柱壓降。選擇1.5-3μm的填料以解決一些復雜樣品,UPLC可以使用1.5μm的填料;另外10μm或更大粒徑的填料用作半制備或制備柱。

      孔徑和比表面積

      孔徑,60A,120A,300A等??讖叫?,則含孔率高,比表面積大,載碳量高;色譜柱填料孔徑大小需和分子大小相匹配,保證分子自由進出填料孔并與孔內表面的鍵合相進行分離分配,通常要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上,一般小分子使用80—120A,大分子使用300A。

      比表面積,指的是每克填料的表面積,如180m2/g—350m2/g,與粒度和含孔率有關;比表面積大,會增加樣品與鍵合相之間的反應,增加保留和分離度;比表面積小則可以縮短分析時間和平衡時間,并不是比表面積大或者小就更好,需要選擇合適的比表面積。

      孔容和機械強度

      孔容,又稱“孔體積”。指單位顆粒的空隙體積大小。它能很好的反應填料的機械強度??左w積大的填料相對孔體積小的填料機械強度要略弱??左w積為1.5mL/g或更小的填料大多用于HPLC分離,而孔體積大于1.5mL/g的填料使用于尺寸排阻色譜和低壓色譜。

       

      液相色譜柱的參數--化學性質

       

      填料基質

      硅膠基質:純度高本錢低,強度大,化學修飾輕易,但pH值范圍有限。大多硅膠基質填料在pH2-8之間穩定,但經過特殊修飾的硅膠鍵合相可以穩定在pH1.5-10。

      聚合物基質:應用pH值范圍寬,溫度穩定(高溫可以達到80度以上),機械強度小。

      含碳量

      含碳量指的是硅膠表面鍵合相的比例,與比表面積和鍵合覆蓋度等有關。高含碳量進步柱容量、分辨率及分析時間,用于要求高分離度的復雜樣品;低含碳量分析時間短、展現不同的選擇性,用于快速分析簡單樣品及需要高含水活動相條件的樣品。一般C18的含碳量在7-19%不等。

      鍵合相

      鍵合試劑不同,對化合物的選擇性不同,一般長鏈的烷基鍵合相(C18 C8)比短鏈的(C4 C3)穩定;非極性的鍵合相比極性的鍵合相(-NH2)穩定。

      封端

      封端能夠降低極性堿性化合物由于與裸露的硅醇基相互作用而產生的拖尾峰。不封端鍵合相相對封端鍵合相會產生不同的選擇性,尤其是極性樣品。

       

      正相—反相色譜對比

       

      液相色譜柱有正相和反相之分。目前市場上主要以反相色譜為主,約占80%的比例。

       

      正相反相色譜柱

       

      現在市面上的液相色譜柱琳瑯滿目,了解色譜柱的參數可以讓我們有一個初步的選擇,但由于各個儀器廠商的填料技術和鍵合技術仍有差異,即使都是C18柱,同一品牌不同系列都有不同的功能,有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。所以在選擇色譜柱前要好好研究色譜柱參數,仔細閱讀色譜柱說明書,才能找到合適的色譜柱和適宜的分離方法。

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